Куриный эмбрион строение. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах. Культивирование на культурах клеток

Цель занятия: ознакомить студентов с методами заражения куриных эмбрионов для культивирования вирусов.

Оборудование и материалы: куриные эмбрионы 9-12 дневного возраста инкубации, овоскоп, спиртовые тампоны, подставки для эмбрионов, пинцеты, ножницы, лейкопластырь, иглы, шприцы, простые карандаши, пробойники, иголочки, таблицы, схемы, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.

Объяснение преподавателя.

Существенно влияет на размножение вирусов в эмбрионах метод заражения. Перед заражением инкубированные яйца про-свечивают, погибшие отделяют. На скорлупе яиц с живыми эмбрионами, кото-рые различают по красному цвету кровеносных сосудов и движению эмбриона, карандашом отмечают место заражения.

Заражают эмбрионы в стерильном боксе, имеющем рабочий стол, два табуре-та, подводку газа, водопровод и вакуум. Заражение в амниотическую полость проводят в затемненной комнате. Рабочее место должно быть хорошо освещено. Перед работой стол дезинфицируют. Для дезинфекции поверхности яиц под-готавливают антисептический раствор (70%-ный спирт, 2%-ный раствор йода) и обернутую ватой деревянную палочку, согнутый зубной зонд или бормашину для просверливания яичной скорлупы. Яйца заражают при помощи стерильных шприца для туберкулинизации и специальных игл. Место заражения на яйце заливают парафином. Для этого готовят парафиновые палочки: в пробирку, за-полненную расплавленным парафином, вводят стеклянную палочку, следя за тем, чтобы она находилась в центре пробирки до остывания парафина.

Когда парафиновая палочка понадобится, стенки пробирки нагревают на го-релке и за стеклянную палочку вытягивают парафин из пробирки. Подержав палочку над пламенем, расплавляют необходимое для закрытия отверстия в яйце количество парафина. Этот способ очень чист, и при нем не образуются пары парафина.

Кроме того, на рабочем столе в боксе размещают стакан со стерильными ватными тампонами, стакан с 3 % раствором едкого натра для использо-ванных инструментов и сосуд с раствором хлорамина для использованных стек-лянных предметов. В случае надобности можно приготовить подставку для яиц, небольшую эмалированную чашку и стерильные питательные среды. Подготов-ленный таким образом рабочий стол в течение 1-2 ч подвергают УФ-облучению .

Учитывая патогенность исследуемых вирусов, работы ведут в маске, резино-вых перчатках и защитных очках.

Существует шесть методов заражения эмбрионов. Наиболее часто используют заражение в аллантоисную полость и на хорионаллантоисную оболочку, реже - в амниотическую полость и в желточный мешочек и совсем редко - в тело зародыша и в кровеносные сосуды ХАО. Выбор метода определяется тропизмом вируса, а также целью заражения. При любом методе заражения вводят 0,1-0,2 мл инфекционного материала.

Заражение в аллантоисную полость.

При заражении этим методом хорошо размножаются вирусы гриппа, ньюкаслской болезни, ринопневмонии лошадей, везикулярного стоматита и др. Существует несколько вариантов метода.

Первый вариант. Эмбрион фиксируют вертикально тупым концом вверх. В скорлупе на стороне зародыша, а иногда с противоположной зародышу стороны на 5-6 мм выше границы воздушной камеры делают отверстие диаметром около 1 мм. Иглу вводят параллельно продольной оси на глубину 10-12 мм (рис. 16). После инъекции вируссодержащего материала иглу извлекают, а отверстие в скорлупе закрывают каплей расплавленного стерильного парафина.

Рисунок 16. Заражение в аллантоисную полость (первый вариант) (по Николау)

Второй вариант. Сделанное в скорлупе над воздушной камерой отверстие используют лишь для выхода части воздуха. Отверстие же для самого заражения делают на участке бессосудистой зоны хорионаллантоисной оболочки (ХАО) со стороны зародыша. Иглу вводят на глубину не более 2-3 мм. Инъецируют инфицирующую жидкость в объеме 0,1-0,2 мл и закрывают отверстие парафином (см. рис. 17).

Заражение на хорионаллантоисную оболочку.

Этот метод заражения куриных эмбрионов чаще используют для культивирования эпителиотропных и пантропных вирусов оспы, инфекционного ларинготрахеита птиц, чумы плотоядных , болезни Ауески , катаральной лихорадки овец и др.

Такое заражение может быть выполнено через естественную или искусственную воздушную камеру.

Для заражения через естественную воздушную камеру эмбрион помещают в штатив вертикально тупым концом вверх и в скорлупе против центра воздушной камеры вырезают круглое окно диаметром 15-20 мм. Через это окно пинцетом снимают подскорлупную оболочку. На обнажившийся участок ХАО наносят 0,2 мм вируссодержащей суспензии (рис. 18), отверстие закрывают лейкопластырем или реже покровным стеклом, укрепив его расплавленным парафином.

Заражение через искусственную воздушную камеру применяют чаще первого, так как оно обеспечивает контакт вируссодержащего материала с большей поверхностью ХАО и, следовательно, ведет к образованию большего количества вируса.

Рисунок 17. Заражение куриного эмбриона в аллантоисную полость (второй вариант) (по Николау)

Рисунок 18. Заражение на ХАО через естественную воздушную камеру (по Николау и др.)

Рисунок 19. Заражение куриного эмбриона на ХАО через искусственную воздушную камеру (по Николау и др.)

Для заражения эмбриона этим методом его помещают в штатив горизонтально зародышем вверх. В скорлупе делают два отверстия: одно небольшое над центром воздушной камеры (предназначено для отсасывания из нее воздуха), а другое диаметром 0,2-0,5 см сбоку, со стороны зародыша. Сложность метода в том, что, делая второе отверстие, необходимо осторожно снять вначале кусочек скорлупы, затем скользящим движением, не повреждая ХАО, сдвинуть подскорлупную оболочку в сторону так, чтобы через образовавшийся дефект мог пройти воздух. После этого резиновой грушей через первое отверстие отсасывают воздух из естественной воздушной камеры (рис. 19, а).В результате через боковое отверстие наружный воздух устремляется внутрь, образуя искусственную воздушную камеру, дном которой является ХАО (рис. 19, б).

Через боковое отверстие на поверхность ХАО наносят инфекционную жидкость и отверстие закрывают кусочком лейкопластыря. Закрывать первое отверстие нет необходимости, так как внутренний листок подскорлупной оболочки при этом методе заражения не нарушается и продолжает выполнять роль барьера для микрофлоры окружающей среды.

Дальнейшую инкубацию эмбрионов, зараженных этим методом, проводят в горизонтальном положении боковым отверстием вверх.

Заражение в желточный мешок.

Большей частью им пользуются для размножения хламидий, а также вирусов болезни Марека , ринопневмонии лошадей, катаральной лихорадки овец и др. Заражают эмбрионы 5-7-дневного, а иногда и 2-3-дневного возраста (вирус лихорадки долины РИФ). Используют два варианта заражения.

Первый вариант. Эмбрионы помещают в штатив в вертикальном положении. Делают отверстие в скорлупе над центром воздушной камеры и вводят иглу на глубину 3,5-4 см под углом 45° к вертикальной оси в направлении, противоположном месту нахождения зародыша (рис. 20).

Рисунок 20. Заражение куриного эмбриона в желточный мешок (по Николау и др.)

Второй вариант. Иногда аналогичный путь заражения осуществляется на горизонтально укрепленном в штативе эмбрионе; при этом зародыш находится внизу, а желток над ним. Отверстие в скорлупе закрывают каплей расплавленного парафина.

Заражение в амниотическую полость.

Для этой цели используют эмбрионы 6 - 10-дневного возраста. Метод используется при культивировании вирусов гриппа, ньюкаслской болезни, ринопневмонии лошадей и др. Есть два способа заражения.

Закрытый способ. Заражение проводят в затемненном боксе. Яйцо помещают на овоскопе в горизонтальном положении зародышем вверх. Через отверстие в скорлупе над воздушной камерой вводят иглу с затупленным концом по направлению к зародышу. Доказательством того, что игла проникла в амнион, служит движение тела зародыша в направлении передвижения.

Открытый способ. Скорлупу над воздушной камерой срезают так, чтобы образовалось окно диаметром 1,5-2,5 см. Через него пинцетом под контролем глаза снимают подскорлупную оболочку. Затем анатомический (14 см) пинцет с сомкнутыми браншами ведут, продавливая хорионаллантоисную оболочку по направлению к зародышу. Когда пинцет достигнет его, бранши размыкают, захватывают амниотическую оболочку вместе с ХАО и подтягивают к окну. Удерживая левой рукой пинцет с фиксированной в нем оболочкой амниона, вводят вируссодержащий материал (рис. 21). Далее все оболочки опускают, окно закрывают лейкопластырем и эмбрион инкубируют в вертикальном положении.

Рисунок 21. Заражение куриного эмбриона в амнион открытым способом (по Николау и др.)

Заражение в кровеносные сосуды ХАО.

При овоскопировании 11- 13-дневных эмбрионов отмечают крупный кровеносный сосуд. По его ходу удаляют участок скорлупы, наносят 1-2 капли спирта, что делает на некоторое время подскорлупную оболочку прозрачной. Под контролем глаза на овоскопе иглу вводят в сосуд, что подтверждается его подвижностью при небольших боковых движениях иглы. Обнаженный участок подскорлупной оболочки закрывают кусочком лейкопластыря.

Можно материал в сосуды ввести и несколько отличающимся способом: срезают скорлупу над воздушной камерой, подскорлупную оболочку смачивают спиртом и в ставшие видными сосуды ХАО вводят материал. Отверстие закрывают кусочком стерильного лейкопластыря.

Описанные технические приемы экспериментального заражения куриных эмбрионов не единственные, а имеют различные варианты.

Заражение в тело зародыша.

Для заражения используют эмбрионы 7-12-дневного возраста. Известно два варианта метода.

Первый вариант. Заражают так же, как в амнион закрытым способом, с той лишь разницей, что берут острую иглу и на овоскопе показателем попадания иглы в тело считают подчинение зародыша движениям иглы.

Второй вариант. Заражают так же, как в амнион открытым способом: через окно в скорлупе подтягивают пинцетом тело зародыша. Материал вводят в головной мозг или определенные участки тела. При таких методах заражения бывает значительный процент неспецифической гибели эмбрионов.

Накопление вируса в курином эмбрионе

Перед дальнейшей инкубацией на скорлупе зараженных любым методом куриных эмбрионов простым (графитным) карандашом пишут, чем заражен эмбрион и когда, а если нужно, то и другие сведения. Зараженные куриные эмбрионы помещают в термостат для дальнейшей инкубации, в процессе которой происходят репродукция внесенных вирусов и их накопление в соответствующих структурах. Температура инкубации эмбрионов варьирует от 33 до 38 °С в зависимости от свойств вируса, которым проведено заражение. За эмбрионами ведут постоянное наблюдение, просматривают на овоскопе, отбирая павшие.

Гибель эмбрионов в первые 24 ч после заражения чаще всего обусловлена размножением грибов, бактериальной микрофлоры, внесенных в эмбрион вместе с инокулятом, или травмированием при заражении. Эта гибель считается неспецифической. В более поздние сроки эмбрионы гибнут в результате, как правило, размножения в эмбрионах вируса. Обнаружив погибшие эмбрионы, их сразу же переносят в холодильник с температурой 4 °С. Такие условия, с одной стороны, способствуют сохранению активности накопившегося в эмбрионе вируса, с другой - уплотнению тканей и запустению сосудов, что значительно облегчает последующее вскрытие.

Эмбрионы инкубируют до момента максимального накопления вируса. Для каждого вируса и даже штамма этот срок является определенным и варьирует в пределах от 2 до 7-8 сут. Так, для вируса ньюкаслской болезни штамма Н он составляет 2-3 дня, для того же вируса штамма В,- 5 дней, для вируса инфекционного ларинготрахеита птиц - 5 дней и т. д. Затем все эмбрионы умерщвляют охлаждением при 4 °С в течение не менее 3-4 ч и вскрывают.

Деэмбринированные яйца.

Воснове метода лежит удаление эмбриона из яйца в период, когда к его скорлупе изнутри полностью прилегает хорионаллантоисная оболочка. Если внутрь такого яйца добавить питательную среду, то образует-ся своеобразная культура ткани, в которой может размножаться вирус. Метод обладает рядом преимуществ: он позволяет получить более чистый вирус, чем в аллантоисно-амниотической жидкости, что важно для снижения аллергизирующих свойств вакцин, приготовленных из этого материала; отсутствие желточного мешка и, следовательно, содержащихся в нем специфических антител позволяет лучше размножаться некоторым вирусам. В некоторых случаях этот метод дает хорошие результаты в диагностических работах, так как при нем можно вводить большие количества исследуемого материала, что увеличивает возможность вы-деления вируса.

Метод предложил Бернкопф еще в 1949 г., но из-за трудностей применения широко не используется. Трудности эти связаны со свойством хорионаллантоисной оболочки в процессе инкубации отделяться от скорлупы, что снижает ценность культуры и затрудняет манипуляции получения вируса и замены пита-тельной среды.

Е. Гройель (1963) ввел ряд модификаций, которые позволили устранить эти трудности. Он предложил использовать 15-дневные и даже более старые яйца, которые в процессе инкубации следует часто переворачивать для равномерного развития оболочки на скорлупе яйца. При просвечивании обозначают границы воздушной камеры. Скорлупу отпиливают на 0,5 см выше этой линии, на край скорлупной оболочки наливают расплавленный парафин (56-58 С°), который застывая, фиксирует край яйца. Затем вырезают круглое отверстие в оболочке над зародышем, оставляя вокруг узкий ободок. Следующий этап - осторожное удаление зародыша из яйца. При этом яйцо следует удерживать в горизонталь-ном положении и медленно поворачивать. Таким путем находят сосуды, связы-вающие эмбрион с ХАО, и перерезают их ножницами. Если яйцо держать верти-кально, то зародыш своей массой оттягивает оболочку, отрывая ее обычно в области острого конца яйца. Попадание даже небольшого количества жидкости между ХАО и скорлупой вызывает полную отслойку оболочки в течение 1-2 дней.

После удаления зародыша оболочку, выстилающую яйцо, несколько раз про-мывают физиологическим раствором, охлажденным до 4-0°С, до тех пор, пока жидкость не станет прозрачной. Затем в полость яйца вводят 20 мл питательной среды, подогретой до 37 °С, и яйцо закрывают стерильным резиновым колпач-ком, предварительно погрузив его в парафин. Трубка с резиновой пробкой, вмонтированная в яйцо, обеспечивает как взятие, так и введение жидкости без опасности бактериального заражения. Такой биологический объект сохраняет жизнеспособность в течение нескольких дней.

По методике Йошино и других, полость деэмбринированных яиц заполняют раствором агара в растворе Хенкса. Заражают деэмбринированные яйца через трубку в колпачке.

Контрольные вопросы:

1. Строение куриного эмбриона.

2. Для чего используют куриные эмбрионы в вирусологии?

3. Каково строение развивающегося куриного эмбриона?

Куриный эмбрион Куриный эмбрион

(КЭ) - куриный зародыш, находящийся на разных стадиях эмбрионального развития. В микробиол. практике используют для выделения, культивирования и идентификации вирусов, риккетсий и иногда бактерий. Для лабораторных целей отбирают свежие, оплодотворенные, с хорошо просвечивающей и не имеющей трещин скорлупой КЭ. Инкубацию проводят в гнездах штатива тупым концом яйца вверх в хорошо вентилируемых инкубаторах или термостатах при 37 -37,5 °С, относительной влажности 63-65%. Для заражения отбирают 4- 13-дневные эмбрионы с выраженными кровеносными сосудами, желточным мешком и подвижной тенью. Перед заражением скорлупу яиц обрабатывают спиртом, обжигают и в области введения (чаще над воздушной камерой) смазывают 2% йодной настойкой. Материал или иссл. к-ру вводят, вскрывая или не вскрывая скорлупу, в желточный мешок (риккетсий), в аллантоисную или амниотическую полости (большинство вирусов), наносят на хорион-аллантоисную оболочку. Реже к-ру вводят в тело эмбриона или в/в. Зараженные КЭ помещают в термостат в условиях и на сроки, к-рые зависят от вида микроба и целей исследования. Некоторые данные о результатах заражения можно получить при внешнем осмотре КЭ под микроскопом (инъекция сосудов, потеря подвижности и др.). Однако в большинстве случаев КЭ вскрывают. Для этого после обработки спиртом и йодной настойкой скорлупу срезают выше границы воздушного мешка, пастеровской пипеткой или шприцем отсасывают сначала аллантоисную, а затем амниотическую жидкость, избегая повреждения сосудов и желточного мешка. Эмбрион и хорионаллантоисную оболочку извлекают из скорлупы, помещают в стерильные чашки, промывают стерильной дистил. водой и осматривают. Дальнейший ход исследования эмбриона и его жидкостей зависит от вида микроба или вируса и целей опыта.

(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)

Смотреть что такое "Куриный эмбрион" в других словарях:

ЭМБРИОТОКСИЧНОСТЬ - эмбриотоксичность, способность физических, биологических, химических и других агентов оказывать отрицательное действие на развивающийся эмбрион. Эмбриотоксическое действие различных веществ устанавливают путем воздействия ими на самок… … Ветеринарный энциклопедический словарь

Запрос «Куры» перенаправляется сюда; см. также другие значения. ? Домашняя курица … Википедия

Куры Куры украшение любого двора Научная классификация Царство: Животные Тип: Хордовые Класс … Википедия

Большое значение в развитии вирусологии имело введение методов культивирования вирусов в куриных эмбрионах. Для репродукции вируса используют куриные эмбрионы 7-12-дневного возраста, инкубированные в термостате при 37 С. Необходимым условием для правильного развития зародыша является соблюдение определенной влажности воздуха, которую можно создать, поместив в термостат сосуд с водой. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах проводится в разных местах эмбриона, который заражают:

1) на хорион-аллантоисную оболочку;

2) в аллантоисную полость;

3) в амниотическую полость;

4) в желточный мешок.

Заражение куриных эмбрионов проводят в боксе с использованием стерильных инструментов. Перед: заражением куриные эмбрионы двукратно протирают ватным тампоном, смоченным спиртом.

Заражение на хорион-аллантоисную оболочку . После дезинфекции яйца осторожно срезают кусочек скорлупы с тупого концы, снимают подскорлупную оболочку - при этом обнаруживается хорион-аллатиоисная оболочка. Инфекционный материал в количестве 0,1-0,2 мл при помощи шприца или пастеровской пипетки наносят па хорион-аллантоисную оболочку. После заражения отверсто закрывают колпачком и просвет между ним и куриным эмбрионом заливают парафином. На другой стороне яйца простым карандашом пишут название инфекционного материала и дату заражения.

Заражение в амниотическую полость. Яйцо овоскопируют и на боковой стороне выбирают участок, где хорион-аллантоис лишен крупных кровеносных сосудов. Этот участок отмечают карандашом. Яйца укладывают на подставку в горизонтальном положении, дезинфицируют и специальным стерильным копьем прокалывают отверстие и скорлупе на глубину 2-3 мм, через которое вводят на это же расстояние иглу с инфекционным материалом непосредственно в амниотическую полость. Для того чтобы вводимая жидкость не вытекала обратно, предварительно делают прокол над воздушным мешком. После чего оба отверстия заливают парафином.

Заражение в аллантоисную полость. Заражение производят и затененном боксе. Отмечают воздушное пространство, скорлупу над воздушным пространством дезинфицируют и через отверстие в скорлупе вводят по направлению к эмбриону иглу шприца с материалом. Если игла попала в аллантоисную полость, то наблюдается смещение тени эмбриона. После заражения отверстие заливают парафином.

Заражение, в желточный мешок. Скорлупу дезинфицируют. Яйцо помещают на подставку тупым концом вправо так, чтобы желточный меток был обращен вверх. Над воздушной камерой в центре прокалывают отверстие. Через отверстие в скорлупе в скорлупе в горизонтальном направлении на глубину 2-3 мм вводят иглу шприца, которая попадает в желточный мешок. Материал вводят в объёме 0,2-0,3 мл. После введения материала отверстие парафинируют.

Температурный режим и длительность инкубации зависят от биологических свойств данного вируса. Инфицированные яйца ежедневно проверяют, овоскопируют для проверки жизнеспособности эмбриона. Если эмбрионы погибают в первые сутки, то причиной этого обычно бывает травма при заражении. Такие яйца выводят из опыта. Наличие вируса в заражённом эмбрионе определяют по характерным изменениям хорион-аллантоисной оболочки зараженного куриного эмбриона. Вирусы, не обладающие гемагпотинирующей активностью, выявляют с помощью РСК. Для выявления вируса в аллантоисной или амниотической жидкостях зараженных эмбрионов ставят РГА.

Выделение и культивирование вирусов

Выделение и идентификация возбудителя - «золотой стандарт» в диагностике вирусных инфекций.

Культуры клеток

Вирусы размножаются только в живых клетках, и выделение возбудителя в заражённой культуре клеток - один из основных методов диагностики вирусных инфекций. Поскольку большинство патогенных вирусов отличает тканевая и типовая специфичность, то почти к каж­дому вирусу можно подобрать соответствующие клеточные или тканевые культуры, а также создать стандартные условия культивирования (наличие клеток одного типа). Размножение вируса обеспечивают чувствительные (пермиссивные) клетки. Поэтому при выделении неизвест­ного возбудителя проводят одномоментное заражение 3-4 культур клеток, предполагая, что одна из них может оказаться пермиссивной. Культуры клеток получают диспергированием соот­ветствующих органов и тканей, но чаще используют эмбриональные ткани (человека и живот­ных) либо трансформированные опухолевые клетки. При помещении на соответствующую плос­кую поверхность клеточные культуры обычно растут в виде монослоя.

Первично-трипсинизированные культуры. Суспензии клеток получают гомогенизиро­ванием соответствующих тканей, предварительно обработанных трипсином. Культуры часто представлены клетками смешанного типа и не подлежат повторному культивированию. Жизнеспособность таких культур составляет 2-3 нед.

Полуперевиваемые линии клеток представлены диплоидными клетками человека и живот­ных. Культуры ограниченно пригодны к повторному диспергированию и росту (как правило, не более 20-30 пересевов), сохраняя при этом жизнеспособность и не подвергаясь спонтан­ной трансформации.

Перевиваемые линии клеток (гетероплоидные культуры) представлены клетками, подверг­нутыми длительному культивированию и спонтанным трансформациям. Культуры способны к многократному диспергированию и перевиванию. Работа с ними менее трудоёмка по сравне­нию с приготовлениями первичных культур; перевиваемые клетки относительно одинаковы по своей морфологии и стабильны по свойствам.

Культуры органов

Не все виды клеток способны расти в виде монослоя, в некоторых случаях поддержание дифференцированных клеток возможно только в культуре органа. Обычно это суспензия ткани, обладающей специализированной функцией, также обозначаемая как культура переживаю­щей ткани.

Куриные эмбрионы (рис. 1-20) - практически идеальные модели для культивирования не­которых вирусов (например, гриппа и кори). Замкнутая полость эмбриона препятствует проник­новению микроорганизмов извне, а также развитию спонтанных вирусных инфекций. Эмбрионы применяют для первичного выделения вирусов из патологического материала; для пассирова­ния и сохранения их, а также для получения необходимых количеств вируса. Некоторые возбу­дители (например, герпесвирусы) вызывают характерные изменения (по ним можно распозна­вать заболевание). Заражение проводят на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую или аллантоисную полость либо в желточный мешок.

Заражение на хорион-аллантоисную мембрану. Обычно используют 10-12-суточные эмбрионы. Яйца просматривают в проходящем свете, отмечают локализацию воздушного мешка и выбирают область без сосудов. Осторожно удаляют фрагмент скорлупы, освобож­дают наружную оболочку и отслаивают её осторожным надавливанием. Затем делают от­верстие у края воздушного мешка. При отсосе через это отверстие хорион-аллантоисная оболочка отслаивается от наружной оболочки. На неё наносят исследуемый материал, сво­бодный от бактерий и простейших (пропущенный через бактериальные фильтры и обрабо­танный бактерицидами).

Заражение в амниотическую полость. Обычно используют 7-14-суточные эмбрионы, у которых после отслоения хорион-аллантоисной оболочки (см. выше) расширяют отверстие, захватывают пинцетом амниотическую оболочку и выводят через хорион-аллантоисную оболочку. Через неё в амниотическую полость вводят исследуемый материал.

Заражение в аллантоисную по­лость. 10-суточные эмбрионы зара­жают через отверстия, сделанные в скорлупе и подлежащих оболочках (см. выше).

Заражение в желточный мешок. Используют 3~8-суточные эмбрио­ны, у которых в этом возрасте жел­точный мешок занимает почти всю полость яйца. Заражение проводят через отверстие, сделанное в воз­душном мешке

Наблюдение и учёт результатов. В качестве вируссодержащего материала можно исполь­зовать содержимое желточного мешка, аллантоисную и амниотическую жидкости либо весь эмбрион, нарезанный вместе с окружающими

тканями на кусочки. Для выявления Рис. 1-20.Схематическое изображение

характер­ных поражений на хорион- развивающегося куриного эмбриона.

аллантоисной мембране удаляют скорлупу

и наружную оболочку. Затем мембрану извлекают и помещают в стерильную воду. Характер поражений изучают на тёмном фоне.

Животные модели

При невозможности выделить и идентифицировать вирус стандартными методами in vitro инфекционный материал вводят чувствительным к возбудителю животным, и после развития типичного инфекционного процесса проводят повторное заражение чувствительных клеточных культур. Наиболее часто используют мышей, кроликов и обезьян; для выделения некоторых вирусов (например, вирусов Коксаки) заражают мышат-сосунков. Вследствие дороговизны и сложности содержания лабораторных животных, практически повсеместно их вытеснили кле­точные культуры. Тем не менее, животные модели активно используют для изучения особенно­стей патогенеза и формирования иммунных реакций при вирусных инфекциях.

III. Методы искусственной физико-химической детоксикации.

III. Перспективные методы лечения инсулинозависимого сахарного диабета

Заражение на хорионаллантоисную оболочку. Этот метод является одним из наиболее употребительных. Основное преимущество его в том, что ряд вирусов при размножении на хорионаллантоисной оболочке вызывают ее характерные изменения, образуя очаги поражения в виде беловатых пятен-бляшек различной морфологии.

Для заражения используют эмбрионы 10-12-дневного возраста. Обычно к хорионаллантоисной оболочке проникают, сделав отверстие в скорлупе над воздушным мешком или же на боковой стороне яйца.

Основные этапы заражения на хорионаллантоисную оболочку со стороны воздушного пространства:

1. Яйцо помещают на подставку в вертикальном положении
так, чтобы воздушный мешок находился наверх}"; проводят
тщательную стерилизацию скорлупы на тупом конце яйца.

2. Над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы
с помощью препаровальной иглы.

3. В образовавшееся отверстие вводят браншу ножниц и
вырезают окно в скорлупе около 1,5см в диаметре. (При этом
нельзя допускать попадания кусочков скорлупы внутрь яйца).

4. Через сделанное отверстие виден внутренний листок
скорлупной оболочки, его осторожно надрывают глазным
пинцетом или иглой и отслаивают на небольшом участке (0,5-1
см 2), обнажив хорионаллантоисную оболочку.

5. Производят заражение хорионаллантоисной оболочки
путем нанесения на нее 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала
(например вируса осповакцины) с помощью пастеровской пипетки
или шприца.

6. Окошко в скорлупе закрывают специальной эластичной
пленкой, стерильным покровным стеклом или стеклянным
колпачком. Для прикрепления стекла и колпачка к скорлупе
пользуются расплавленным парафином.

Зараженные эмбрионы помещают в термостат в вертикальном положении и инкубируют в течение 2-3 суток, после чего производят вскрытие по следующим правилам:

1. Яйцо помещают на подставку так, чтобы воздушное
пространство было наверху, проводится стерилизация места
предстоящего вскрытия путем соответствующей обработки
спиртом и йодом.

2. Удалив пленку, покровное стекло или колпачек,
стерильными ножницами срезают скорлупу по границе воздушного
пространства.

3. Пользуясь пинцетом, снимают скорлупную оболочку.
Обнаженную хорионаллантоисную оболочку (на которой могут
быть видимые изменения) подрезают вдоль края скорлупы. Через
образовавшееся отверстие выливают все содержимое яйца в чашку
или лоток.

4. Оставшуюся внутри скорлупы хорионаллантоисную
оболочку осторожно извлекают пинцетом и помещают в
стерильную чашку с физиологическим раствором. Здесь ее
расправляют и изучают изменения, поместив чашку на темный
фон.

Для получения из хорионаллантоисной оболочки материала, содержащего вирус, ее нужно измельчить ножницами и затем растереть в ступке с кварцевым стеклом, добавив солевой раствор. Полученную суспензию центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10-15 минут и надосадочную жидкость использую! в качестве вируссодержащего материала (требуется обязательная проверка на отсутствие бактериального загрязнения).

Заражение в аллантоисную полость. Этот метод

отличается своей простотой и ценен тем, что способствует значительному накоплению вируса. Для заражения обычно берут эмбрионы 10-И - дневного возраста. Основные этапы заражения в аллантоисную полость:

}. Яйцо помещают на подставку тупым концом кверху и проводят стерилизацию скорлупы над воздушным пространством.

2. В центре тупого конца делают прокол скорлупы с
помощью препаровальной иглы.

3. В отверстие вводят иглу шприца, содержащего разведение
вируса (например вируса гриппа). Иглу продвигают в
вертикальном направлении на 2-3 мм ниже уровня воздушного
мешка и затем вводят ОД-0,2 мл материала.

4. Отверстие в скорлупе заделывают с помощью
расплавленного стерильного парафина.

Заражённые эмбрионы выдерживают в термостате обычно в течение 2 суток. Перед вскрытием яйца помещают на ночь в холодильник при 4°. Вскрытие производится в следующем порядке:

1.Яйцо устанавливают на подставке так, чтобы воздушный мешок находился наверху, скорлупу над ним стерилизуют;

2. С помощью ножниц скорлупу срезают немного выше
границы воздушного пространства.

3. Осторожно удаляют пинцетом скорлупнуюоболочку, после
чего хорионаллантоисную оболочку прокалывают пастеровской
пипеткой в том месте, где нет сосудов, и насасывают аллантоисную
жидкость (ее удается набрать 5-6 мл).

4. Аллантоисную жидкость переносят в стерильную
пробирку, а часть засевают в бульон для проверки на
бактериологическую стерильность.

Метод заражения в аллантоисную полость часто применяют для культивирования вируса гриппа, а также паротита и осповакцины.

Заражение в полость амниона

Этот метод более труден для выполнения и применяется несколько реже предыдущих. Особенностью его является то, что при заражении некоторыми пневмотропными вирусами (например, вирусами гриппа, паротита), последние размножаются не только в клетках оболочки амниона, но и в дыхательных путях и легочной ткани эмбриона, куда проникает инфицированная жидкость. Для заражения используют эмбрионы 7-12 - дневного возраста. Заражение в амниотическую полость проводят открытым методом, когда для введения материала в скорлупе делается сравнительно большое отверстие, или же закрытым методом, когда заражение производят через прокол скорлупы.

Первый из них более травматичен, второй - менее надежен, так как, действуя вслепую, не всегда удается ввести иглу в полость амниона.

Техника открытого метода заражения:

1. Яйцо помещают на подставку и проводят стерилизацию
скорлупы в области тупого конца.

2. Над центром воздушного пространства в скорлупе
ножницами вырезают окошко величиной 2 см в поперечнике (как
для заражения на хорионаллантоисную оболочку).

3. Осторожно снимают внутренний листок скорлупной
оболочки с помощью пинцета, обнажая подлежащую
хорионаллантоисную оболочку.

Прорезают ножницами небольшое отверстие в
хорионаллантоисной оболочке в том месте, где нет кровеносных сосудов, и вводят в прорез глазной пинцет. Пинцетом захватывают оболочку амниона и вытягивают амниотический мешок над поверхностью хорионаллантоисной оболочки.

5. Удерживая- амниотическую оболочку в этом положении,
производят заражение в полость амниона, вводя шприцем 0,1-
0,2 мл разведения вируса.

6. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным колпачком
или покровным стеклом, пользуясь для их фиксации и
герметизации яйца расплавленным парафином.

Зараженные эмбрионы инкубируют в течение 2 суток, выбраковывая погибшие в течение первых суток (наблюдения ведут через окошко в скорлупе). После вскрытия эмбрионы выдерживают в течение ночи в холодильнике при 4° С.

Техника вскрытия эмбриона при заражении в амниотическую полость:

1. Простерилизовав место предстоящего вскрытия, срезают
скорлупу немного выше края воздушного мешка.

2. Прокалывают хорионаллантоисную оболочку
пастеровской пипеткой и удаляют аллантоисную жидкость.

3. Захватив пинцетом амниотический мешок, прокалывают
его оболочку иглой шприца или пастеровской пипеткой и
насасывают амнистическую жидкость (от 0,5 до 1,5 мл). У
зараженного эмбриона жидкость должна быть мутной, между тем
как у нормального эмбриона она прозрачна.

4. Взятую жидкость переносят в стерильную пробирку, 0,1-
0,3 мл ее засевают в бульон для контроля на бактериологическую
стерильность.